一、PCR實(shí)驗(yàn)室概述
PCR 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或體外酶促基因擴(kuò)增法。其基本原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過程，是在模板 DNA、引物和 4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，該技術(shù)可以將極微量的靶DNA 特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得所需的大量特定基因片段，因此能在臨床上檢測單分子 DNA或每 10 萬個(gè)細(xì)胞中僅含 1 個(gè)靶 DNA 分子的樣品。
二、PCR 實(shí)驗(yàn)室平面布局
根據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室需要設(shè)置試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)等四個(gè)區(qū)域。如使用全自動分析儀，區(qū)域設(shè)置可以適當(dāng)合并。雖然 PCR 實(shí)驗(yàn)室的四個(gè)功能分區(qū)是固定的，但各醫(yī)院在實(shí)際布置中卻千差萬別，其主要布置形式有分散式和集中式兩種。
分散式：各實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散布置形式。各實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾。
集中式：完成 PCR 四個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰布置，形成集中、獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)域。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置獨(dú)立緩沖間、實(shí)驗(yàn)室間應(yīng)設(shè)置帶消毒裝置的傳遞窗。
在理想情況下，PCR 實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。若房間進(jìn)深允許，可設(shè) PCR 內(nèi)部專用走廊。在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染，達(dá)到人、物分流。
三、PCR 實(shí)驗(yàn)室的主要功能和設(shè)備配置
1. 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)
該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
2. 標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸 (RNA、DNA) 提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時(shí)cDNA 的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。
3. 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA 擴(kuò)增。此外，已制備的 DNA 模板和合成的 cDNA( 來自樣本制備區(qū) ) 的加入和主反應(yīng)混合液 ( 來自試劑貯存和制備區(qū) ) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式 PCR 測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
四、PCR 實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)設(shè)計(jì)
1. 設(shè)計(jì)依據(jù)
國際上，世界衛(wèi)生組織（WHO）一直非常重視實(shí)驗(yàn)室生物安全問題，早在 1983 年就出版了《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊》，2003年4月第二版 ( 修訂版 ) 以電子版形式在 WHO 網(wǎng)頁上問世。美國在實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理方面更是走在了世界的前列，NIH/CDC 聯(lián)合出版的《微生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全準(zhǔn)則》現(xiàn)已推出了第四版。很多國家在制定本國的生物安全準(zhǔn)則時(shí)，主要參考上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。我國關(guān)于 PCR 實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及管理的現(xiàn)行技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)有以下幾種：
《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》
《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)【2010】194 號
《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》
《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》 GB50346-2011
《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》GB19489-2008
《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》GB50073—2013
《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》WS233-2002 中華人民共和國衛(wèi)生部
  實(shí)驗(yàn)室規(guī)范《JGJ91 科學(xué)實(shí)驗(yàn)室建筑設(shè)計(jì)規(guī)范》等
2. 設(shè)計(jì)參數(shù)
根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》：對于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。典型的二級生物安全水平實(shí)驗(yàn)室（圖片由CUH2A，Princeton, NJ, USA 提供）。根據(jù)《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》GB50346-2011 中，生物安全實(shí)驗(yàn)室分級。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所處理對象的生物危害程度和采取的防護(hù)措施，生物安全實(shí)驗(yàn)室分為四級。微生物生物安全實(shí)驗(yàn)室二級可采用BSL-2 表示。

 
根據(jù)《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》GB50346-2011生物安全實(shí)驗(yàn)室二級屏障的主要技術(shù)指標(biāo)：
  
根據(jù)《臨床基因擴(kuò)增（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范》中對于房間正負(fù)壓的要求：標(biāo)本制備區(qū)：可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。擴(kuò)增區(qū)：可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：采用負(fù)壓條件或減壓情況下 ( 如安裝排風(fēng)扇 ) 可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。
另外，根據(jù)《JGJ91 科學(xué)實(shí)驗(yàn)室建筑設(shè)計(jì)規(guī)范》：
噪聲要求：通用實(shí)驗(yàn)室、學(xué)術(shù)活動室允許噪聲級不宜大于55dB(A 聲級 )；研究工作室、閱覽室允許噪聲級不應(yīng)大于 50dB(A 聲級 )。采暖空調(diào)溫、濕度要求：采暖地區(qū)通用實(shí)驗(yàn)室的冬季采暖室內(nèi)計(jì)算溫度應(yīng)為 18~20℃。通用實(shí)驗(yàn)室的夏季空氣調(diào)節(jié)室內(nèi)計(jì)算參數(shù)為：溫度26~28℃，相對濕度小于 65%。
總結(jié)各規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)際使用需求，以下是空調(diào)通風(fēng)室內(nèi)設(shè)計(jì)參數(shù)總結(jié)表：通過工藝平面設(shè)計(jì)，使 PCR 實(shí)驗(yàn)室具有合理的功能布局，以符合生物安全規(guī)范中潔污分流和防止交叉感染等方面的要求；同時(shí)通過對送入室內(nèi)的新風(fēng)量和排出室外的排風(fēng)量進(jìn)行控制，使室內(nèi)按照設(shè)計(jì)要求建立相應(yīng)的壓力梯度，防止污染物的進(jìn)入或擴(kuò)散；采取過濾或殺菌消毒措施有效去除空氣中會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的微生物和塵埃等；采取合理的氣流組織，保證室內(nèi)氣流均勻、減少死角，并保證全面通風(fēng)時(shí)的氣流組織與生物安全柜等局部排風(fēng)裝置運(yùn)行時(shí)的氣流組織相協(xié)調(diào)。
3. 空調(diào)設(shè)計(jì)
空調(diào)負(fù)荷主要有以下幾部分構(gòu)成：圍護(hù)結(jié)構(gòu)負(fù)荷、人員負(fù)荷（一般少于常規(guī)房間）、照明負(fù)荷、設(shè)備負(fù)荷（包含生物安全柜、冰箱、離心機(jī)、滅菌鍋、凍干機(jī)等設(shè)備）、新風(fēng)負(fù)荷（最大組成部分）。
采取的空調(diào)形式可以有兩種：
1）全空氣系統(tǒng)
設(shè)置全空氣空調(diào)系統(tǒng)時(shí)，采取以下措施：
初效 +中效 +高效的三級過濾；
空調(diào)風(fēng)機(jī)變頻，選用運(yùn)行曲線陡降型；
對于設(shè)置生物安全柜的房間設(shè)置變風(fēng)量新風(fēng)系統(tǒng)；全面排風(fēng)與生物安全柜排風(fēng)分開設(shè)置。
2）凈化風(fēng)機(jī)盤管 + 變風(fēng)量新風(fēng)系統(tǒng)
設(shè)置凈化風(fēng)機(jī)盤管 + 變風(fēng)量新風(fēng)系統(tǒng)時(shí)，采取以下措施：
凈化風(fēng)機(jī)盤管送、回風(fēng)口采用低阻高中效過濾器，超低阻高中效過濾器對大氣菌的過濾效率達(dá)到 95%；
新風(fēng)系統(tǒng)根據(jù)房間內(nèi)生物安全柜的運(yùn)行情況變頻運(yùn)行；
全面排風(fēng)與生物安全柜排風(fēng)分開設(shè)置。
4. 通風(fēng)過濾與氣流組織設(shè)計(jì)
1）通風(fēng)系統(tǒng)：全面通風(fēng)：換氣次數(shù)≥6次/ 小時(shí)；送風(fēng)采用新風(fēng)機(jī)組經(jīng)熱、濕處理及三級（初效+中效+亞高效）過濾后送入室內(nèi)；排風(fēng)口設(shè)置于房間的下部，且在排風(fēng)口設(shè)置高效過濾器；新風(fēng)機(jī)組和排風(fēng)機(jī)均采用變頻機(jī)組，以應(yīng)對工況的改變。
局部排風(fēng)：生物安全柜，柜口面風(fēng)速≥ 0.5m/s；采用Ⅱ級 B2 型生物安全柜；生物安全柜排風(fēng)系統(tǒng)單獨(dú)設(shè)置，高空排放，且在排風(fēng)入口設(shè)置高效過濾器，室外排風(fēng)口高于所在建筑物屋面2m 以上；多臺生物安全柜并聯(lián)運(yùn)行時(shí)應(yīng)采用變風(fēng)量排風(fēng)系統(tǒng)，其新風(fēng)補(bǔ)風(fēng)系統(tǒng)也應(yīng)變風(fēng)量運(yùn)行。
2）過濾：英國倫敦公共衛(wèi)生中心實(shí)驗(yàn)室 Nobel 的測定結(jié)果顯示，空氣中某些病毒和細(xì)菌的單體氣溶膠等效中值直徑為7.7~17.2μm 之間。因此，PCR 實(shí)驗(yàn)室末端過濾器采用亞高效過濾器（粒徑≥ 0. 5μm，99.9>η>95，額定風(fēng)量下的初阻力≤ 120Pa，效率為大氣塵計(jì)數(shù)效率）滿足使用要求。
3）氣流組織：為避免交叉污染，PCR 實(shí)驗(yàn)室空氣流向必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行。
此外，還需遵循以下原則：氣流組織采用上送下排，送風(fēng)口和排風(fēng)口布置應(yīng)使室內(nèi)氣流停滯的空間降低到最小程度。在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠操作地點(diǎn)的上方附近不得設(shè)送風(fēng)口。單向布置，不應(yīng)有障礙。高效過濾器排風(fēng)口應(yīng)設(shè)在室內(nèi)被污染風(fēng)險(xiǎn)最高的區(qū)域。
5. 壓差控制
PCR 實(shí)驗(yàn)室壓差控制方案：
風(fēng)量和排風(fēng)量：縫隙法計(jì)算實(shí)驗(yàn)室及緩沖間保持一定壓力時(shí)所需要的送風(fēng)計(jì)算公式：

其中 △P—壓差（Pa）
Ρ —空氣密度，取 1.2kg/m³
V—流量，m3/h
A—根據(jù)縫隙寬度計(jì)算的泄漏面積㎡
μ—常數(shù)，取0.72
由以上公式可知，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)排風(fēng)量確定的情況下，通過調(diào)節(jié)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的送風(fēng)量可以維持房間和參照區(qū)域恒定的壓差。此計(jì)算風(fēng)量可以作為設(shè)計(jì)的依據(jù)，由此來對新風(fēng)機(jī)組、排風(fēng)機(jī)組及附屬的風(fēng)管、風(fēng)口等進(jìn)行選型和計(jì)算。但是在實(shí)際操作中，施工安裝的門、窗的結(jié)構(gòu)形式及氣密性等參數(shù)可能會與設(shè)計(jì)院選用的設(shè)計(jì)值有偏差；實(shí)驗(yàn)室長期運(yùn)行后維護(hù)結(jié)構(gòu)的氣密性和縫隙的寬度也會發(fā)生一定的變化，這些因素都會對原縫隙法計(jì)算的結(jié)果造成影響，進(jìn)而使室內(nèi)的壓力梯度變化，嚴(yán)重時(shí)影響實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是人員進(jìn)出房間開、關(guān)門時(shí)的漏風(fēng)，會迅速破壞室內(nèi)的壓力梯度。
由于以上問題的存在，再進(jìn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)室個(gè)房間壓差控制時(shí)，除了通過縫隙法計(jì)算基礎(chǔ)風(fēng)量外，還通過安裝壓差控制器，測量實(shí)驗(yàn)室、緩沖間與參照區(qū)域間的實(shí)際壓差，和設(shè)定值進(jìn)行比較，根據(jù)控制器的PID運(yùn)算得出偏差值，以此為信號控制送風(fēng)閥的動作，進(jìn)而對房間送風(fēng)量及送 / 排風(fēng)量差進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而最終控制房間的壓差值。這種控制需要系統(tǒng)中的變風(fēng)量調(diào)節(jié)閥實(shí)現(xiàn)閉環(huán)控制，同時(shí)需要送、排風(fēng)閥的執(zhí)行機(jī)構(gòu)有快速的反應(yīng)能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明，控制生物安全柜排風(fēng)的變風(fēng)量調(diào)節(jié)閥響應(yīng)時(shí)間小于1S且實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)系統(tǒng)的風(fēng)量平衡相應(yīng)時(shí)間小于3S時(shí)，生物安全柜調(diào)節(jié)窗位置改變不會引起柜內(nèi)氣體外溢的現(xiàn)象發(fā)生。

為了防止實(shí)驗(yàn)室開 / 關(guān)門窗引起室內(nèi)與緩沖間、緩沖間與專用走道間出現(xiàn)壓差為0時(shí)送風(fēng)系統(tǒng)變風(fēng)量風(fēng)閥開度很小甚至關(guān)閉的情況發(fā)生，PCR 實(shí)驗(yàn)室送風(fēng)變風(fēng)量閥應(yīng)預(yù)設(shè)風(fēng)量偏移限制，以避免特殊情況發(fā)生導(dǎo)致大面值泄漏時(shí)出現(xiàn)送風(fēng)量過小的現(xiàn)象發(fā)生。
五、參考文獻(xiàn)
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10.《高效空氣過濾器》GB13554-2008
11.《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊》第四版